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Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 1537 (2023) Citar este artículo

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La expresión de la proteína del marco de lectura abierto 1 (ORF1p) del elemento 1 intercalado largo (LINE-1) es una característica común de muchos tipos de cáncer, incluido el carcinoma de ovario seroso de alto grado (HGSOC). Aquí, informamos que ORF1p no solo se expresa sino que también se libera por el cáncer de ovario y las células tumorales primarias. Los ensayos de espectrometría de masas de monitoreo de inmuno-reacción múltiple mostraron que ORF1p liberado es detectable con confianza en medios acondicionados, ascitis y plasma de pacientes, lo que implica a ORF1p como un biomarcador potencial. Curiosamente, la expresión de ORF1p es detectable en los precursores epiteliales de la trompa de Falopio (FT) de HGSOC pero no en la FT benigna, lo que sugiere que la expresión de ORF1p es un evento temprano en el desarrollo de HGSOC. Finalmente, el tratamiento de las células FT con inhibidores de la ADN metiltransferasa condujo a una expresión y liberación sólidas de ORF1p, lo que validó el papel regulador de la metilación del ADN en la represión de LINE-1 en tejido no tumorigénico.

El cáncer de ovario sigue siendo una de las principales causas de mortalidad relacionada con el cáncer en los países desarrollados y representa aproximadamente 180 000 muertes en todo el mundo al año1. Solo en los Estados Unidos, la Sociedad Estadounidense del Cáncer estima que se produjeron 19 880 casos nuevos y más de 12 810 muertes por cáncer de ovario en 20222,3. El cáncer de ovario es una enfermedad heterogénea y el subtipo más común es el carcinoma de ovario seroso de alto grado (HGSOC)4. La mayoría de los pacientes con HGSOC se presentan para recibir atención con enfermedad avanzada, momento en el que las remisiones prolongadas después de la terapia primaria son raras y las recurrencias se caracterizan por una mayor quimiorresistencia. Por lo tanto, existe una gran necesidad de mejorar las estrategias para la detección temprana del cáncer de ovario para reducir la mortalidad5,6. Desafortunadamente, aún no se ha desarrollado una prueba de detección adecuadamente sensible y específica que mejore la supervivencia. Actualmente, la mejor herramienta disponible para la evaluación de la enfermedad ovárica es la ecografía transvaginal (TVS). Sin embargo, múltiples estudios a gran escala no han logrado demostrar una sensibilidad y especificidad adecuadas para TVS para garantizar su uso como herramienta de detección7,8. Si bien CA-125 y HE4 son biomarcadores bien caracterizados en el cáncer de ovario9,10,11,12,13, su aplicación clínica actualmente está restringida al análisis de la eficacia terapéutica y la detección de la recaída de la enfermedad14. Hallazgos recientes del estudio United Kingdom Collaborative Trial of Ovarian Cancer Screening (UKCTOCS) sugieren que el cribado multimodal con suero CA-125 interpretado mediante el algoritmo de riesgo de cáncer de ovario (ROCA), la ecografía transvaginal y la evaluación clínica pueden conducir a un cambio a -detección y tratamiento de estadios15. Desafortunadamente, el seguimiento a largo plazo en el estudio UKCTOCS mostró que la reducción en la incidencia de estadio III o IV observada con la detección multimodal no se tradujo en vidas salvadas16. Es importante tener en cuenta que aproximadamente el 20 % de los cánceres de ovario no producen CA-125 y no se detectarían con un enfoque que dependiera únicamente de este biomarcador17. Juntos, estos hallazgos refuerzan la necesidad de identificar biomarcadores ampliamente aplicables que se derivan de una comprensión más completa de la biología de la enfermedad.

Con la evolución de las tecnologías proteómicas, es posible realizar una caracterización sistemática de las proteínas que los tipos de células residentes en el microambiente tumoral liberan al espacio intersticial. El líquido intersticial tisular (TIF) está compuesto por el líquido entre los vasos sanguíneos y las células de los tejidos circundantes, constituye el 16 % del peso del cuerpo humano y representa una fuente novedosa y muy prometedora de biomarcadores18. Recientemente completamos un análisis de todo el proteoma de TIF del epitelio normal de las trompas de Falopio (FT) y HGSOC coincidente (Gillette et al., manuscrito en preparación). Entre las proteínas detectadas de forma más diferencial en el TIF de HGSOC se encuentra la proteína ORF1 del elemento retrotransponible del elemento 1 intercalado largo (LINE-1) (ORF1p).

Los elementos transponibles (TE) se pueden separar en dos clases principales: transposones de ADN y retrotransposones. Los retrotransposones son, con mucho, los TE más abundantes en el genoma humano y se autopropagan a través de intermediarios de ARN que se transcriben de forma inversa y se insertan en nuevas ubicaciones genómicas19. Los retrotransposones se pueden subdividir en dos grupos, que se distinguen por la presencia o ausencia de repeticiones terminales largas (LTR). La gran mayoría de los TE humanos reflejan la actividad presente y pasada de los retrotransposones no LTR, tipificados por LINE-120,21. Los elementos LINE-1 son los retrotransposones codificadores de proteínas más abundantes y únicos activos, y representan aproximadamente el 17% del genoma humano. Aproximadamente, 500 000 copias truncadas y 6000 copias completas de LINE-1 están presentes en el genoma humano22. La transcripción está impulsada por un promotor interno de ARN polimerasa II rico en dinucleótidos CpG21,22, pero la expresión en células humanas adultas generalmente se suprime por la metilación del ADN20. Curiosamente, la pérdida de la metilación del ADN de LINE-1 es un fenotipo común que se encuentra en el cáncer de ovario y otros tipos de cáncer19.

LINE-1 contiene dos marcos de lectura abiertos (ORF): ORF1 codifica una proteína de unión a ARN (ORF1p) y ORF2 codifica una proteína con actividades de transcriptasa inversa y endonucleasa (ORF2p)21,23. La expresión anómala de ORF1p se ha documentado en una serie de estudios sobre cánceres epiteliales, incluidos los de ovario24,25,26,27,28,29,30,31, y convierte a ORF1p en un biomarcador de cáncer prometedor. A pesar de los altos niveles de ORF1p que se encuentran en las células cancerosas, nunca se ha demostrado la expresión de ORF2p utilizando métodos estándar para la detección de proteínas32.

En el presente estudio, mostramos que ORF1p no solo se expresa sino que también se libera por HGSOC y líneas celulares de tumores primarios. Desarrollamos ensayos de enriquecimiento de inmunoafinidad a nivel de péptido (Immuno-MRM, iMRM33,34,35,36,37,38,39,40) combinados con espectrometría de masas dirigida para detectar ORF1p secretado en medios acondicionados, ascitis y plasma del paciente. muestras También mostramos que la expresión de ORF1p es un evento temprano en el desarrollo de HGSOC, ya que la tinción de ORF1p se encuentra de manera sólida en muestras de lesiones STIC. Además, ORF1p se encontró en lesiones STIC incidentales de cirugías de reducción de riesgo y sin enfermedad invasiva, lo que valida que la transición de epitelio FT normal a lesiones precursoras de HGSOC está marcada por la adquisición de la expresión de ORF1p que se retiene en HGSOC avanzado. Curiosamente, descubrimos que los agentes de desmetilación del ADN desencadenan la expresión y liberación de ORF1p por parte de las células FT, lo que valida experimentalmente la metilación del ADN como un mecanismo necesario para restringir la expresión de ORF1p en las células FT benignas.

Los casos para este estudio se obtuvieron de los Departamentos de Patología del Brigham and Women's Hospital y del Hospital de la Universidad de Pensilvania. Se cortaron bloques de tejido de las trompas de Falopio fijados en formalina e incrustados en parafina (FFPE) de 30 casos cuyos informes patológicos originales indicaban la presencia de HGSOC. Entre esos casos, 18 incluyeron el diagnóstico de STIC y 25 tenían epitelio FT benigno. También obtuvimos 12 casos de FT benigno de pacientes a los que se les extirparon las trompas por razones no relacionadas con el cáncer o el riesgo de cáncer y seis casos de STIC (solo carcinoma in situ) incidentales identificados en cirugía de reducción de riesgo para mutaciones BRCA1/2. Estos portaobjetos de hematoxilina y eosina (H&E) fueron revisados por tres patólogos (MSH, LS, RD) para confirmar la presencia de STIC y posiblemente carcinoma invasivo en las secciones de tejido más profundas. Las muestras de plasma utilizadas en este estudio se obtuvieron del depósito del Dr. Steven Skates en el Hospital General de Massachusetts. Se analizaron setenta y dos muestras de plasma de pacientes con carcinoma de ovario seroso papilar en estadio avanzado (III y IV) (Tabla complementaria 1) y 37 muestras de plasma de control.

La tinción inmunohistoquímica se realizó utilizando el sistema Envision Plus/Peroxidasa de rábano picante (DAKO). Las secciones de tejido FFPE se desparafinizaron, rehidrataron e incubaron en una solución de peróxido de hidrógeno durante 30 min para bloquear la actividad de la peroxidasa endógena. La recuperación del antígeno se llevó a cabo con un tratamiento a 100 °C en tampón citrato (pH 6,0) durante 20 min. Las secciones se incubaron con el anticuerpo primario durante la noche a 4 °C. El anticuerpo secundario se aplicó durante 30 min, seguido de 3,3′-Diaminobencidina (DAB) durante 5 min. Todas las imágenes de H&E e IHC se capturaron con el escáner de portaobjetos Aperio CS2 de Leica BioSystems (Buffalo Grove, IL).

Usamos anticuerpos monoclonales anti-LORF1 (clon 4H1; Millipore) para investigar la expresión de ORF1p. La tinción ORF1p fue calificada por dos patólogos ginecólogos (LES y MSH) utilizando la siguiente escala de 4 niveles: 0 (todas las células negativas), 1 + (células raras dispersas ≤ 10 % de células positivas), 2 + (tinción focal o multifocal = 10 –75% de células positivas), o 3+ (tinción difusa ≥ 75% de células positivas). Todas las tinciones y puntajes fueron revisados por un tercer patólogo (RD) y se dividieron en dos grupos: los puntajes de 0 y 1+ se definieron como "ORF1p negativo", mientras que los puntajes de 2+ y 3+ se clasificaron como "ORF1p positivo".

Las células se cultivaron durante la noche en cubreobjetos de vidrio. Las células se fijaron con paraformaldehído al 4 %/PBS durante 20 min a temperatura ambiente. Las células se bloquearon con BSA al 3 % en PBS 1X y se incubaron con el anticuerpo primario durante la noche a 4 °C. El anticuerpo secundario se incubó durante 0,5 horas a temperatura ambiente. La detección se realizó utilizando anticuerpos secundarios conjugados con Alexa 488 Fluor Dyes (Molecular Probes; Thermo Fisher Scientific). Los cubreobjetos se montaron en portaobjetos de vidrio utilizando un medio que contenía DAPI. Las células se analizaron por microscopía usando un microscopio Nikon E400.

En este estudio se utilizaron ocho líneas celulares de carcinoma de ovario (KURAMOCHI, OVCAR-3, OVCAR-4, OVCAR-8, OVKATE, COV318, OVSAHO y CaOV3). Todas las líneas celulares de cáncer de ovario, excepto COV318 y CaOV3, se cultivaron en RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientific) suplementado con suero bovino fetal al 10 % (FBS; Atlanta Biologicals). COV318 y CaOV3 se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Thermo Fisher Scientific) con suero bovino fetal al 10 %. Todas las líneas celulares se autenticaron mediante el perfil de repetición en tándem corto (STR) (IDEXX, Columbus, MO) en 2022 y se probaron para estar libres de Mycoplasma mediante el ensayo Cambrex MycoAlert (Centro Celular de la Facultad de Medicina Perelman de la Universidad de Pensilvania). El establecimiento de las líneas celulares de las trompas de Falopio (FT189, FT194, FT237, FT240 y FT246) fue descrito previamente41,42. Las células FT se cultivaron en DMEM/Ham's F-12 1:1 (Thermo Fisher Scientific) suplementado con sustituto de suero Ultroser G al 2% (Pall Life Sciences). Las células HGSOC primarias (líneas celulares DF) se aislaron como se describió anteriormente43. Las células DF se cultivaron en Renaissance Essential Tumor Medium (RETM; Cellaria Biosciences) complementado con 5% de FBS inactivado por calor. Todas las células se cultivaron a 37 ° C y una atmósfera que contenía CO2 al 5% (consulte la Tabla complementaria 2).

Las líneas de células FT cultivadas se trataron con Decitabine (TOCRIS, Cat. #2624) o SGI-110 (Guadecitabine) (Adooq Bioscience, Cat. #A12744) a una concentración de 5 μM (en DMSO) durante 3, 5 o 7 días. Como control, las células se trataron con vehículo solo.

Todas las células se cultivaron hasta una confluencia del 80%. A continuación, se cambió el medio a medio sin FBS (líneas celulares de carcinoma de cáncer de ovario) o sustituto de suero Ultroser G (Pall Life Sciences) (líneas celulares FT) y las células se cultivaron durante 72 h más. A continuación, el medio acondicionado se aclaró mediante centrifugación y se concentró utilizando un filtro centrífugo Millipore Amicon Ultra-15 (Millipore Sigma). El contenido de proteínas del medio acondicionado se cuantificó usando el protocolo del kit Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific) y se realizó el bot occidental como se describe a continuación.

Se prepararon lisados de células completas utilizando tampón M-PER (Thermo Fisher Scientific). El contenido de proteínas del lisado de células enteras se cuantificó utilizando el protocolo del kit Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific). Las proteínas (20–30 µg) se separaron en un gradiente de SDS-PAGE del 4–20 % antes de transferirlas a una membrana de PVDF mediante el sistema Turbo Blot (Bio-Rad). Las membranas se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C (consulte la Tabla complementaria 3). Después del lavado, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP durante 1 hora a temperatura ambiente. Las proteínas se detectaron utilizando el reactivo de detección de anticuerpos HRP quimioluminiscente Clarity (Bio-Rad) y se visualizaron con un sistema de imágenes Chemi-Doc (Bio-Rad). Las transferencias sin recortar para todas las figuras se pueden encontrar en las figuras complementarias. 1–4.

La metilación de LINE-1 se evaluó mediante el kit Global DNA Methylation—LINE-1 (Active Motif, Cat. n.º 55017) siguiendo las recomendaciones del fabricante. El kit LINE-1 es un ensayo basado en ELISA para la detección y cuantificación de los niveles de 5-metilcitosina en el ADN genómico humano. Brevemente, las líneas celulares FT se trataron con decitabina o DMSO como se describió anteriormente. A continuación, se extrajo el ADN genómico (ADNg) con el kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen, nº de catálogo 69504). Un μg de gDNA de cada muestra se digirió durante la noche con la enzima MseI (10 U/μL) a 37 °C. Se hibridaron 100 ng de gDNA digerido con la sonda LINE-1 en un termociclador (98 °C durante 10 min, 68 °C durante 1 h seguido de una rampa rápida a 25 °C). La sonda LINE-1 es un oligo biotinilado en 5' diseñado para hibridar con una región de 290 pb del elemento repetido LINE-1. Esta región contiene 88 residuos de citosina, de los cuales 12 están en un contexto CpG. Las reacciones se prepararon por triplicado técnico. Las muestras de PCR se transfirieron a una placa recubierta de estreptavidina y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente con agitación suave. Luego, se incubó una dilución 1:100 de anticuerpo monoclonal de 5-metilcitosina durante 1 hora a temperatura ambiente seguido de 1 hora de incubación del anticuerpo secundario conjugado con HRP. Se añadió la solución de desarrollo y se incubó durante 3 min hasta la adición de la solución de parada. Finalmente, se leyó la placa a 450 nm. Las muestras estándar de ADN metilado y no metilado se prepararon en paralelo con las muestras tratadas con decitabina.

Los medios acondicionados de cáncer de ovario o células epiteliales de Falopio de control se digirieron con tripsina porcina siguiendo nuestro protocolo de urea previamente descrito33. Brevemente, se añadieron 36 mg de urea (Sigma-Aldrich) a 100 μl de medio acondicionado hasta una concentración final de 6 M. El pH de la solución se ajustó a 8,0 según fuera necesario con 1 M Tris pH 8,0. Las proteínas se redujeron con 6 μL de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) 0,5 M (Bio-Rad) y se incubaron 30 min a 37 °C. Las muestras se enfriaron a temperatura ambiente y se alquilaron mediante la adición de 12 μl de yodoacetamida 0,5 M (IAA) (Sigma-Aldrich) recién preparada a partir de polvo antes de la incubación en ausencia de luz directa durante 30 min a temperatura ambiente. La concentración de urea se diluyó a menos de 2 M con 400 μL de Tris HCl 0,2 M pH 8,1, se agregaron 2 ug de tripsina (Promega) (promedio 1:50 E:S) y las muestras se incubaron en un termomezclador (Eppendorf) durante 16 h a 37 °C y 800 RPM. Después de 16 h, se agregaron 2 μg de tripsina fresca y se incubó 2 h a 37 °C y 800 RPM. Después de 2 h, se añadieron 20 μL de ácido fórmico puro para extinguir la reacción (pH final < 2,5). Las muestras digeridas se desalinizaron por separado utilizando cartuchos de extracción Oasis® HLB de 10 mg montados en un colector de vacío (Waters). Antes de cargar la muestra, los cartuchos se humedecieron con 1 ml de acetonitrilo al 90 %/ácido fórmico al 0,1 % y se equilibraron con 1 ml de ácido fórmico al 0,1 %. Después de cargar cada muestra, los cartuchos se lavaron con 3 ml de ácido fórmico al 0,1 % y los péptidos se eluyeron en un politubo nuevo de 1,5 ml utilizando dos adiciones de 0,3 ml de acetonitrilo al 40 %/ácido fórmico al 0,1 %. Las muestras se secaron mediante centrifugación al vacío y se almacenaron secas a -80 °C hasta su uso.

El líquido de ascitis recogido de pacientes con cáncer de ovario se digirió con lys'C y tripsina porcina siguiendo nuestro protocolo de urea previamente descrito34. Brevemente, se agregaron 60 μL de urea 9 M (Sigma-Aldrich) a 30 μL de líquido ascítico (concentración promedio de proteína 33,7 mg/mL por BCA) hasta una concentración final de 6 M. El pH de la solución se ajustó a 8,0 como necesario con Tris 1 M pH 8,0. Las proteínas se redujeron con 6 μL de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) 0,5 M (Bio-Rad) y se incubaron 30 min a 37 °C. Las muestras se enfriaron a temperatura ambiente y se alquilaron mediante la adición de 12 μl de yodoacetamida 0,5 M (IAA) (Sigma-Aldrich) recién preparada a partir de polvo antes de la incubación en ausencia de luz directa durante 30 min a temperatura ambiente. La concentración de urea se diluyó a 1,5 M con 300 μl de Tris HCl 0,2 M, pH 8,1. Se disolvió lisil endopeptidasa (lys-C) (Wako) en ácido acético 50 mM a una concentración de 0,5 mg/ml y se añadieron 40 μl a cada muestra (promedio 1:50 E:S). Las muestras se incubaron en un termomezclador (Eppendorf) durante 2 h a 37 °C y 800 RPM. Después de 2 h, se agregaron 10 μg de tripsina (Promega) (promedio 1:100 E:S) y las muestras se incubaron 16 h a 37 °C y 800 RPM. Después de 16 h, se agregaron 10 μg de tripsina fresca y se incubó 2 h a 37 °C y 800 RPM. Se añadieron veinte microlitros de ácido fórmico puro para extinguir la reacción (pH < 2,5). Se agregaron estándares de péptidos pesados (75 fmol cada uno) a cada pozo de digestión y las muestras se desalinizaron usando una placa de extracción Oasis® HLB de 30 mg (Waters) montada en un colector de presión positiva (Waters). Los pocillos se lavaron con 1,5 ml de acetonitrilo al 80 %/ácido fórmico al 0,1 % y se equilibraron con 2 ml de ácido fórmico al 0,1 % aplicando 15 psi. Se agregaron 0,2 ml adicionales de ácido fórmico al 0,1 % al cartucho húmedo antes de transferir las muestras con una pipeta multicanal. Después de cargar las muestras, los cartuchos se lavaron a presión positiva (9 psi) con 3 ml de ácido fórmico al 0,1 %. Después del lavado, los péptidos plasmáticos digeridos se eluyeron con dos volúmenes de 0,5 ml de acetonitrilo al 50 %/ácido fórmico al 0,1 % (6 psi). La placa de elución se cubrió con película BioExcell® (World Wide Medical Products), se congeló y secó mediante centrifugación al vacío, luego se selló con papel de aluminio y se almacenó a -80 °C hasta su uso.

Cuarenta microlitros de plasma por paciente con cáncer de ovario se dispensaron manualmente en 96 placas de pocillos profundos por triplicado y se digirieron con lys-C y tripsina utilizando nuestro protocolo de urea adaptado para la automatización como se describió anteriormente34. Brevemente, se agregaron 100 μL de urea 9 M y 25 μL de TCEP 0,25 M a los cuadrantes 1 y 2 de una placa de 384 pocillos (Greiner) para cada pocillo correspondiente de una placa de 96 pocillos que contenía muestra (Fig. 5A complementaria) y se colocaron en posición 7 en un robot Bravo LT (Agilent) (Fig. 6 complementaria). La placa de muestras, las placas de reactivos, las puntas de pipeta y las placas de solventes se cargaron en Bravo LT como se muestra en la figura complementaria 6. Bravo LT se cubrió con una cubierta negra personalizada para minimizar la penetración de la luz y se inició el programa de digestión de Bravo. Se agregaron ochenta microlitros de urea 9 M y 15 μL de tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) (Bio-Rad) 0,25 M a cada muestra y la placa de muestra se movió al agitador de temperatura controlada en la posición 4 (Fig. 6 complementaria). ) y se incubó 30 min a 37 °C y 800 RPM. La yodoacetamida (IAA) (Sigma-Aldrich) se disolvió en Tris HCl 0,2 M pH 8,1 hasta una concentración final de 0,5 M y se agregaron 50 μL en el cuadrante 3 de la placa de 384 pocillos en la posición 7 en la plataforma Bravo (Fig. 6). Después de 30 minutos de desnaturalización de la proteína TCEP, el robot Bravo movió la placa de muestra nuevamente a la posición 5 y agregó 20 μL de 0.5 M IAA en cada muestra antes de incubar 30 minutos sin mezclar en la oscuridad. La lisil endopeptidasa (lys-C) (Wako) se disolvió en ácido acético 50 mM a una concentración de 0,5 mg/ml y se añadieron 100 μl al cuadrante 1 de la placa 2 de 384 pocillos (Fig. 5B complementaria). Se agregaron cien microlitros de tripsina porcina (Promega) formulada en ácido acético 50 mM a 0,5 mg/mL al cuadrante 2 de la placa 2 (Fig. 5B complementaria) y se colocó en la posición 6 en Bravo LT (Fig. 6 complementaria). Después de 30 min de alquilación de la proteína IAA, se añadieron 300 μL de Tris HCl 0,2 M pH 8,1 y 100 μL de lys-C (E:S 1:50). La placa de muestra se transfirió manualmente a un termomezclador fuera de línea (VWR) y se incubó durante 2 h a 37 °C y 800 RPM. Después de la digestión con lys-C, la placa de muestra se volvió a colocar en la posición 5 en la plataforma Bravo (Fig. 6 complementaria) y se aspiraron 48 μL de tripsina en cada pocillo de muestra (E:S 1:100). La placa de muestra se transfirió manualmente a un termomezclador fuera de línea (VWR) y se incubó durante 2 h a 37 °C y 800 RPM. Después de 2 h, se aspiró en las muestras una segunda adición de tripsina de 48 μL. A continuación, se detuvo el método Bravo, se cubrió la placa con un sello de plástico y se incubó durante 16 h a 37 °C y 800 RPM en un termomezclador fuera de línea. Después de 16 h, se dispensaron 90 μL de ácido fórmico al 10 % en cada muestra para extinguir la actividad enzimática (concentración final del 1 %). Se añadieron estándares de péptidos pesados (150 fmol cada uno) a cada pozo de digestión y se desalinizaron utilizando una placa de extracción Oasis® HLB de 30 mg (Waters) montada en un colector de presión positiva (Waters). Los pocillos se lavaron con 1,5 ml de acetonitrilo al 80 %/ácido fórmico al 0,1 % y se equilibraron con 2 ml de ácido fórmico al 0,1 % aplicando 15 psi. Se agregaron 0,2 ml adicionales de ácido fórmico al 0,1 % al cartucho húmedo antes de transferir las muestras con una pipeta multicanal. Después de cargar las muestras, los cartuchos se lavaron a presión positiva (9 psi) con 3 ml de ácido fórmico al 0,1 %. Después del lavado, los péptidos plasmáticos digeridos se eluyeron con dos volúmenes de 0,5 ml de acetonitrilo al 50 %/ácido fórmico al 0,1 % (6 psi). La placa de elución se cubrió con película BioExcell® (World Wide Medical Products), se congeló y secó mediante centrifugación al vacío, luego se selló con papel de aluminio y se almacenó a -80 °C hasta su uso.

Se seleccionaron cuatro péptidos exclusivos del producto del gen LINE-1 ORF1p/L1RE1 (LORF1, Uniprot Q9UN81, LORF1_HUMAN) como inmunógenos para la generación de anticuerpos: LTADLSAETLQAR, LSFISEGEIK, LIGVPESDVENGTK y NEQSLQEIWDYVK. Los anticuerpos policlonales de conejo se generaron en conejos blancos de Nueva Zelanda siguiendo un protocolo estándar de 77 días (péptido de Nueva Inglaterra) como se describió anteriormente con modificaciones35. En resumen, los péptidos se sintetizaron con una pureza del 85 % con una cisteína adicional en el extremo N y se conjugaron con KLH para la inmunización. Se combinaron los péptidos y se inmunizaron dos conejos en dosis descendentes durante 70 días. Los títulos de antisuero de las muestras de sangre finales se midieron mediante ELISA peptídico. Dos péptidos con el título más alto, LSFISEGEIK y LIGVPESDVENGTK, se purificaron en serie a partir de un grupo de sangrados finales mediante cromatografía de afinidad usando una columna Sulfolink (Thermo Fisher Scientific) unida con el péptido inmunizante. En resumen, los sueros se unieron a la columna que contenía el péptido con el título más bajo; luego, el flujo continuo, que se esperaba que contuviera anticuerpos específicos para los péptidos de mayor título subsiguientes, se unió a la columna que contenía el péptido con el siguiente título más alto para maximizar el rendimiento de cada anticuerpo. Después de unir el antisuero, se usó un lavado prolongado (> 100 CV) para reducir el péptido pasajero latente antes de la elución con tampón de glicina pH 2,5. Los anticuerpos purificados se dializaron en glicerol al 25 %/PBS 1X/NaN3 al 0,1 % y se almacenaron a -20 °C hasta su uso.

Veinte microgramos de cada anticuerpo se incubaron con perlas magnéticas de Proteína G (Thermo Fisher Scientific) a 4 °C durante la noche usando una proporción de 2:1 de volumen de perlas por μg de anticuerpo. Después de lavar las perlas con PBS 1X/CHAPS al 0,03 %, la mitad de las perlas de anticuerpo se entrecruzaron usando DMP 20 mM como se describió previamente37. La eficiencia de captura de anticuerpos y la determinación del péptido pasajero se realizaron agregando péptidos pesados al plasma o tampón de control digerido y enriqueciendo usando anticuerpos con y sin entrecruzamiento (consulte la sección "Enriquecimiento por inmunoafinidad de péptidos automatizado en KingFisher"). Se usaron cromatogramas de iones extraídos de péptidos pesados para comparar la eficiencia de captura, mientras que la abundancia relativa de señal de péptido ligero se usó para estimar el porcentaje de péptido pasajero en el anticuerpo. Se sintetizaron los péptidos "pesados" correspondientes que contenían una lisina marcada con un isótopo estable en el extremo C, se purificaron a más del 95 %, se formularon en acetonitrilo al 30 %/ácido fórmico al 0,1 % y se cuantificaron mediante análisis de aminoácidos (péptido de Nueva Inglaterra). Los péptidos pesados se analizaron mediante LC-MRM-MS como una mezcla de las versiones "ligera" (endógena) y "pesada" (estándar) del péptido para determinar la cantidad relativa de péptido no marcado en el estándar de péptido pesado (ver "NanoLC-MRM -Sección "Análisis MS").

Las muestras digeridas secas de 100 μL de medio acondicionado, 30 μL de líquido ascítico o 20 μL de plasma se resuspendieron en 200 μL 1 × PBS/150 mM Tris pH 8,0/0,03 % CHAPS y se mezclaron brevemente en vórtex a temperatura ambiente antes de transferirlas a un recipiente de 250 μL. Placa de pocillos KingFisher (excepto las muestras de plasma, que se secaron directamente en la placa de pocillos). Los péptidos se extrajeron utilizando perlas magnéticas en el manipulador de perlas magnéticas KingFisherTM mediante enriquecimiento por inmunoafinidad (IAE) como se describió anteriormente33. En resumen, una mezcla de anticuerpos que contenían una cantidad optimizada de Ab por IAE (p. ej., 0,5 μg, 1 μg o 2 μg) se unió a perlas magnéticas de proteína G de 1 μm (Thermo Fisher Scientific) mediante mezcla en tambor (Labquake® (Thermo Fisher Scientific) Scientific)) usando 2 μL de perlas/1 μg de anticuerpo durante la noche a 4 °C. Las perlas de anticuerpo se lavaron dos veces con 1 × PBS/CHAPS al 0,03 %, se resuspendieron en un volumen equivalente a 1 × PBS/CHAPS al 0,03 % y se agregaron a cada pocillo. La placa se selló con un adhesivo de lámina de aluminio y se mezcló suavemente durante la noche a 4 °C. Después de la incubación, la placa se transfirió a un procesador de perlas magnéticas KingFisherTM (Thermo Fisher Scientific) equipado con un cabezal magnético de PCR. Las perlas se lavaron dos veces con 250 μl de 1 × PBS/CHAPS al 0,03 % durante 1,5 min y una vez con 0,1 × PBS/CHAPS al 0,03 % durante 1,5 min. Después del lavado, las perlas se transfirieron a una placa de PCR de 100 μL que contenía 50 μL de acetonitrilo al 3 %/ácido acético al 5 % para eluir el material unido. Después de la elución, las perlas se recogieron en una placa que contenía 200 μl de PBS 1X/CHAPS al 0,03 %/azida sódica al 0,1 %.

Las muestras enriquecidas con anticuerpos se desalinizaron con cartuchos AssayMAP Bravo Reverse Phase S (RPS)34. Los eluatos de perlas de anticuerpo en una placa PCR Bio-Rad de 96 pocillos se colocaron en Bravo en la posición 6. Los cartuchos AssayMAP RPS y los disolventes se colocaron en Bravo como se describe en la figura complementaria 6. Los cartuchos RPS se cebaron con 50 µl de acetonitrilo al 90 %/0,01 %. ácido fórmico a 300 μL/min y equilibrado con 50 μL de ácido fórmico al 0,1 % a 25 μL/min. Luego, las muestras se cargaron en cartuchos a 2 μL/min. Los cartuchos se lavaron dos veces con 50 μL de ácido fórmico al 0,1 % y se eluyeron con 50 μL de acetonitrilo al 40 %/ácido fórmico al 0,01 % a 5 μL/min. Los eluatos se secaron y se resuspendieron en acetonitrilo al 3 %/ácido acético al 5 % antes del análisis LC-MRM-MS.

Las muestras desalinizadas enriquecidas con anticuerpos de medios acondicionados, ascitis y plasma se analizaron en un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo TSQ Quantiva instalado con una fuente Nanospray Flex (Thermo Fisher Scientific) y un sistema Easy-nLC 1000. La fuente de iones se configuró en modo de iones positivos con una temperatura capilar de 300 °C, un voltaje de rociado de 2000 y un gas de barrido configurado en 0. El sistema Easy-nLC 1000 se cebó con la fase móvil A (3 % de acetonitrilo/0,1 % de ácido fórmico), la fase móvil B (90% acetonitrilo/0,1% ácido fórmico). Las muestras se inyectaron (4 μL, 40 % de la muestra enriquecida) en una columna PicoFrit (New Objective) de 0,075 mm de DI, se llevó a un emisor de 10 μm y se empaquetó a la medida hasta 20 cm con perlas de 1,9 μm 200 Å C18-AQ Reprosil (Dr. Maisch). El gradiente de LC fue del 5 % de B durante 3 min, del 5 % de B al 40 % de B en 50 min, del 40 % de B al 90 % de B en 2,3 min. Se monitorearon tres transiciones por péptido mediante MRM programado usando una ventana de RT de 8 min y un tiempo de ciclo de 1,5 s. Las energías de colisión se optimizaron en 4 pasos, 2,5 V por paso en lotes no programados más pequeños de menos de 500 transiciones por lote.

Los cromatogramas de iones extraídos (XIC) de todos los iones de transición se integraron mediante un documento Skyline (Skyline versión 4.1.0.11796 https://brendanx-uw1.gs.washington.edu/labkey/project/home/software/Skyline/begin.view44. La abundancia relativa de péptidos se informó como una proporción del área del pico ligero al pesado.

El análisis estadístico se realizó utilizando GraphPad Prism 8 (GraphPad Software Inc.). Las diferencias en la inmunorreactividad de ORF1p o las puntuaciones compuestas entre FTE, STIC y HGSOC invasivo morfológicamente normales se examinaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis, seguida de la prueba de Dunn para comparaciones múltiples de grupos. El análisis estadístico de los resultados de cuantificación de iMRM se realizó utilizando MSstats v3.7.3 a nivel de péptido en las intensidades log2 de los péptidos endógenos para cada transición después de la normalización al péptido estándar marcado con isótopo estable correspondiente. Los datos se exportaron desde Skyline y se formatearon de forma personalizada para permitir que MSstats analizara los datos de iMRM por separado por péptido para cada proteína. Se incluyeron áreas de pico de todas las muestras independientemente de si se detectaron niveles endógenos de péptido mediante inspección manual de los XIC.

El estudio se realizó de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Este estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Brigham and Women's Hospital (BWH), el Hospital General de Massachusetts (MGH), Boston, MA, y la Universidad de Pensilvania (UPenn). Todos los protocolos para la recolección de sangre fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional del Hospital General de Massachusetts y todos los sujetos dieron su consentimiento informado por escrito.

Se ha demostrado la expresión restringida de LINE-1 ORF1p en tejido tumorigénico en una variedad de cánceres, incluido el de ovario. Dado que las proteínas específicas del cáncer pueden servir como biomarcadores potenciales, evaluamos la expresión de ORF1p en el contexto de dos biomarcadores de cáncer de ovario aprobados por la FDA, HE4 y CA-125. Como se esperaba, solo las líneas de células cancerosas expresaron ORF1p, HE4 y CA-125. En particular, observamos que cada marcador exhibió un patrón único de expresión en los diferentes lisados de líneas celulares (Fig. 1A). Por ejemplo, aunque ORF1p se expresó en células COV318, estas células no expresaron HE4 o CA-125. De manera similar, las células OVSAHO expresaron únicamente HE4 pero ORF1p o CA-125 insignificantes (Fig. 1A). Dado que la expresión de ORF1p se observa en una amplia gama de muestras de cáncer de ovario y es independiente de HE4 y CA-125, postulamos que ORF1p puede servir como un analito útil en una herramienta de detección multimodal y de múltiples biomarcadores para el cáncer de ovario.

LINE1 ORF1p es detectable en medios acondicionados de HGSOC y es complementario a otros biomarcadores conocidos. (A) Lisados de células enteras. Expresión de proteínas ORF1p, HE4 y CA125 (WB) en líneas celulares FT y HGSOC. Los marcadores analizados muestran una expresión diferencial entre las células FT y HGSOC. Se utilizó vinculina como control interno. (B) Expresión de la proteína ORF1p (WB) en medios sin suero acondicionados de FT y HGSOC. (C) lisado de células enteras. Expresión de proteína ORF1p (WB) en seis células HGSOC primarias derivadas de líquido de ascitis (células DF). Se utilizó vinculina como control interno. (D) Expresión de la proteína ORF1p (WB) en células HGSOC primarias en medios acondicionados sin suero.

Para probar más a fondo el potencial de ORF1p como biomarcador, evaluamos si las células de cáncer de ovario pueden liberar ORF1p en los medios. Para ello, analizamos los medios acondicionados de células en cultivo. Como era de esperar, ninguna de las líneas celulares FT liberó ORF1p. Por el contrario, las líneas celulares de cáncer de ovario liberan ORF1p fácilmente detectable, excepto Kuramochi y OVSAHO (Fig. 1B), que también mostraron una expresión más baja de ORF1p en lisados de células enteras (Fig. 1A). Para evaluar si la expresión y la liberación de ORF1p observadas en las líneas celulares HGSOC eran artefactos del cultivo celular, también examinamos ORF1p en células tumorales primarias derivadas del líquido ascítico de pacientes con HGSOC avanzado (líneas celulares DF45). De hecho, observamos que las seis líneas celulares primarias de DF tenían expresión ORF1p detectable (Fig. 1C) y liberaban ORF1p en medios acondicionados (Fig. 1D). En conjunto, la expresión de ORF1p se limita a las células cancerosas, y su liberación en los medios celulares convierte a ORF1p en un buen candidato para investigar su potencial como biomarcador.

La liberación de ORF1p por parte de las células HGSOC nos llevó a preguntarnos si ORF1p podría detectarse en fluidos biológicos de pacientes con la enfermedad. Para abordar esta posibilidad, desarrollamos un monitoreo de reacciones inmunomúltiples seguido de ensayos de espectrometría de masas (iMRM-MS) para detectar dos péptidos que identifican de manera única ORF1p (consulte la sección "Métodos").

En primer lugar, para evaluar el rendimiento del ensayo, preparamos curvas de respuesta en un fondo de plasma estándar, utilizando la señal peptídica endógena presente en la muestra como referencia. Los péptidos sintéticos fuertemente marcados de LINE-1 ORF1p se agregaron a 10 μL de plasma digerido en niveles que oscilaron entre 5 amol/μL y 50 pmol/μL por triplicado. Usando el programa Quasar en Skyline para el análisis de la curva de respuesta y asumiendo un nivel endógeno de 1 fmol/μL en la muestra, el límite de detección fue de 80 amol/μL para el péptido LIGVPESDVENGTK y 280 amol/μL para el péptido LSFISEGEIK en plasma (Fig. .7A y B).

A continuación, para evaluar si iMRM-MS proporciona una lectura similar de la abundancia relativa de ORF1p a la de los análisis de transferencia Western y podría aplicarse para medirla en fluidos biológicos complejos, evaluamos la expresión de ORF1p mediante iMRM-MS en conjuntos complementarios de medios condicionados de células líneas y cultivos de pacientes primarios. En medios acondicionados, los resultados de iMRM-MS fueron muy similares a los que encontramos en transferencias Western, con concentraciones de ORF1p más altas en sobrenadantes de células COV318 e indetectables en sobrenadantes de cultivos de células FT sanas (Fig. 2A). Los medios acondicionados de las líneas celulares primarias del DF humano no se analizaron mediante iMRM-MS; sin embargo, los niveles de ORF1p en las muestras de líquido ascítico del paciente de las que se derivaron esas líneas celulares se midieron y detectaron en los seis casos (Fig. 2B). Dadas las diferencias sustanciales esperadas en la carga tumoral intraperitoneal y los volúmenes totales de ascitis entre pacientes, hubo un sorprendente grado de concordancia en las intensidades relativas de la señal de ORF1p entre los sobrenadantes de cultivos HGSOC primarios y muestras de ascitis pareadas medidas por Western blot e iMRM-MS, respectivamente. (Figs. 1D, 2B). Sin embargo, las señales para DF106 fueron marcadamente diferentes, ORF1p fue un orden de magnitud más alto en DF106 que otras muestras de ascitis según lo medido por iMRM-MS (Fig. 2B), mientras que su nivel estaba en el extremo inferior de la distribución cuando se midió en primaria sobrenadantes de líneas celulares por Western blot (Fig. 1D). No obstante, los datos sugieren que los niveles de ORF1p son detectables por iMRM-MS en fluidos biológicos, aunque los resultados de DF106 enfatizan que factores adicionales pueden influir en la abundancia medida de ORF1p en matrices biológicas complejas.

LINE-1 ORF1p se detecta mediante iMRM-MS en medios acondicionados, ascitis y plasma de pacientes con HGSOC. (A) Los sobrenadantes de las líneas celulares FT y HGSOC y (B) las células HGSOC primarias de la ascitis de los pacientes se analizaron mediante iMRM-MS. La relación del área del pico (PAR) de péptido ligero a pesado para la única mejor transición se normalizó a la cantidad de proteína en cada muestra. PAR para cada muestra se normalizó a la muestra con el valor más alto y se informó como un porcentaje para cada péptido. (C) Proporción de área de pico de péptido ligero a pesado que muestra la detección relativa y la diferencia entre muestras sanas y con enfermedad de una cohorte independiente que contiene 72 casos de HGSOC y 37 controles sanos (N = 109 muestras de plasma de pacientes en total).

Además, usamos iMRM-MS para evaluar ORF1p en todos los tipos de muestras, incluida la fuente de la señal (células STIC o HGSOC), el líquido ascítico y la circulación periférica, mediante la evaluación de conjuntos complementarios de muestras de medios acondicionados de líneas celulares (que sirven como un proxy para la concentración peritumoral) y líquido o plasma de ascitis de pacientes con estadios predominantemente avanzados de HGSOC (Figura complementaria 7C-E) (Métodos y Tabla complementaria 3). Como se esperaba, la cantidad de señal de MS del péptido ORF1p se correlacionó inversamente con la concentración de la matriz de fondo. El uso de enriquecimiento de péptidos con anticuerpos seguido de MS dirigida identificó con confianza al menos uno de los péptidos ORF1p, LSFISEGEIK, en aproximadamente el 10 % de las muestras de plasma, aunque con una intensidad de señal 30 veces menor que en los medios celulares acondicionados (2500 frente a 75 000 cps) ( Figura complementaria 7E frente a 7C). Si bien la dilución de la señal desde la fuente hasta la circulación probablemente fue un factor central, la concentración de los péptidos ORF1p se mantuvo baja incluso después del enriquecimiento de anticuerpos, posiblemente debido a la supresión de la señal de péptidos de unión no específicos o de baja afinidad con una abundancia endógena mucho mayor.

Se realizaron experimentos adicionales para determinar si la señal detectada (2500 cps) procedía de proteína endógena en plasma o representaba un artefacto técnico debido a un marcaje isotópico incompleto del péptido pesado38 o al péptido pasajero en el anticuerpo (péptidos unidos al anticuerpo policlonal durante el proceso de generación de anticuerpos y purificación por afinidad; véase la sección "Métodos")35. Como se muestra en la Fig. 8A complementaria, la intensidad de la señal de luz observada en una muestra de péptido pesado fue muy baja, menos de 300 cps, y para cualquier señal detectable, la proporción de transiciones no coincidió con la del estándar pesado. La intensidad de la señal del péptido ligero se mantuvo baja y sin cambios con el enriquecimiento de anticuerpos en el tampón y el plasma de control, y en todos los casos tenía una relación de transición inconsistente con la del péptido pesado. Por lo tanto, no hubo evidencia para respaldar un artefacto debido a péptidos exógenos. Aunque en el plasma del paciente la relación del área del pico ligero:pesado de ORF1p estaba por debajo de lo que generalmente se considera una relación cuantificable (0,007), era claramente mayor que la señal en las muestras de prueba de control (Fig. 8B complementaria).

Finalmente, realizamos ensayos de iMRM-MS en una cohorte de 109 muestras de pacientes que comprendían 72 pacientes con cáncer y 37 pacientes sanos, por separado en tres días separados, utilizando el marco estadístico proporcionado en MSstats (consulte la sección "Métodos")46. Como se muestra en la Fig. 2C, hubo una tendencia de concentraciones más altas de ORF1p en las muestras de HGSOC en comparación con los controles, aunque el cambio de veces (log2 = 0,035) no fue estadísticamente significativo.

En conjunto, estos resultados demuestran que ORF1p se puede detectar con confianza en el torrente sanguíneo de pacientes con HGSOC. Sin embargo, se requerirían mejoras adicionales en los límites de cuantificación del ensayo y una población de prueba más grande para proporcionar estimaciones cuantitativas más precisas del rendimiento de ORF1p como biomarcador de diagnóstico en plasma.

La observación de que ORF1p se expresa en células HGSOC y es detectable en fluidos biológicos nos llevó a investigar si la expresión de ORF1p es un evento temprano o tardío en la tumorigénesis de HGSOC. Utilizamos inmunohistoquímica (IHC) para evaluar la expresión de ORF1p en muestras de tejido de 30 pacientes diagnosticados con HGSOC y 12 controles sanos. Se realizaron tinciones de p53 y Ki-67 para identificar células de carcinoma y células proliferativas, respectivamente (Fig. 3A). En los casos HGSOC, se identificaron uno o más STIC en 18 especímenes, mientras que FTE morfológicamente normal adyacente estaba presente en 25 casos. El epitelio FT normal fue negativo para la expresión de ORF1p, mientras que HGSOC fue difusamente positivo en casi todos los casos (Fig. 3A, Tabla 1). La falta de expresión en el epitelio FT se observó en casos con y sin STIC o HGSOC, lo que sugiere que el epitelio FT benigno normal es negativo para ORF1p. La expresión en HGSOC fue generalmente robusta y difusa (Fig. 3A, B) con una distribución citoplásmica o pancelular (Fig. 3B). Curiosamente, cuando dicotomizamos las puntuaciones de IHC en grupos negativos (0 y 1) y positivos (2 y 3), la expresión en lesiones STIC fue sólida con 14/18 casos mostrando positividad (Fig. 3A, Tabla 1).

La expresión de LINE-1 ORF1p es un evento temprano en la tumorigénesis del cáncer de ovario seroso. (A) Expresión de ORF1p de LINE-1 (IHC) en tejido de epitelio de trompa de Falopio (FTE) morfológicamente benigno, carcinoma intraepitelial tubárico seroso (STIC) y carcinoma de ovario seroso de alto grado invasivo (HGSOC). ORF1p abundante se expresa en lesiones STIC y HGSOC, mientras que el FTE normal es negativo. La tinción de p53 identifica las células de carcinoma y Ki-67 las células proliferativas en el STIC y el tumor invasivo. Se tomaron imágenes de todas las micrografías (objetivo 20X) de un caso representativo para alinear la ubicación de las lesiones. (B) Distribución celular de ORF1p en HGSOC. Se muestran dos casos representativos, que exhiben un patrón de tinción citoplásmica y membranosa (objetivo 40X).

Estudios genómicos recientes de precursores de FT y HGSOC han demostrado que en casos de HGSOC avanzado, la presencia de lo que parece ser STIC en el FT puede ser en realidad una enfermedad metastásica disfrazada de precursor47,48,49,50. Para abordar esta posibilidad, teñimos seis casos de lesiones STIC incidentales de cirugías de reducción de riesgo para la expresión de ORF1p. En estos casos, no hay enfermedad invasiva. La expresión de ORF1p se detectó en cuatro de los seis casos. Como en los casos con HGSOC, la expresión de ORF1p fue robusta en las células STIC malignas y no en el epitelio FT normal adyacente (Fig. 4). Estos resultados confirman que la expresión de ORF1p se produce en los precursores de FT de HGSOC.

LINE-1 ORF1p se expresa en lesiones STIC incidentales. Imágenes representativas de tinción con hematoxilina y eosina (H&E), p53 y expresión de LINE-1 ORF1p en epitelio de la trompa de Falopio (FTE) y lesiones de carcinoma intraepitelial tubárico seroso (STIC) (IHC). Las lesiones STIC incidentales muestran una expresión robusta de ORF1p citoplásmica y pancelular (20X). No hay expresión de ORF1p en el epitelio benigno adyacente. La tinción intensa de p53 nuclear es característica de la lesión STIC y es negativa en el tejido normal. Las micrografías insertadas (40X) resaltan las células ciliadas normales en FTE benigno y las células malignas en la lesión STIC.

Está bien documentado que en las células somáticas normales, la metilación del ADN y los mecanismos relacionados inhiben la expresión del retrotransposón LINE-1. Sin embargo, en las células neoplásicas, el ADN suele estar hipometilado, lo que lleva a una mayor expresión de LINE-1 observada en una variedad de cánceres, incluido el de ovario26,51,52. Para evaluar si la desmetilación del ADN podría inducir la expresión y liberación de LINE-1 en células FT no tumorigénicas, tratamos cuatro líneas celulares FT diferentes con el inhibidor de la metiltransferasa de ADN (DNMTi) decitabina (5 μM) durante 3, 5 o 7 días. Como se esperaba, el tratamiento con decitabina condujo al agotamiento de DNMT1A (Fig. 5A) ya una disminución en la metilación de LINE-1 en las líneas celulares FT (Fig. 5B). Con respecto a ORF1p, las cuatro líneas FT mostraron una expresión robusta de ORF1p después del tratamiento, mientras que DMSO solo no tuvo efecto (Fig. 5C). Además, probamos un DNMTi de segunda generación, SGI-110 (guadecitabina), que se diseñó racionalmente para que fuera resistente a la degradación por la citidina desaminasa y para prolongar la exposición de las células al metabolito activo, la decitabina, lo que garantiza una mayor absorción en el ADN de células rápidamente células en división53,54. De acuerdo con nuestros resultados anteriores, el tratamiento con SGI-110 5 μM condujo a una fuerte expresión de ORF1p tan pronto como 3 días después del tratamiento (Fig. 5D). El tratamiento prolongado durante 5 o 7 días condujo a una mejora adicional de la expresión de ORF1p, mientras que el DMSO no tuvo ningún efecto (Fig. 5D). La microscopía de inmunofluorescencia confirmó la expresión de ORF1p en células FT tratadas con decitabina frente a células FT no tratadas. De acuerdo con la localización intracelular de ORF1p en HGSOC, ORF1p se encontró predominantemente en el citoplasma de las células FT tratadas con DNMTi (Fig. 5E).

La pérdida de metilación del ADN en las células de las trompas de Falopio conduce a la expresión y detección de LINE-1 ORF1p en medios acondicionados. Las líneas de células FT se trataron con inhibidores de DNMT Decitabine o SGI-110 (5 µM) durante 3, 5 o 7 días. Se usó DMSO como control negativo. (A) Expresión de la proteína DNMT1A (WB) y (B) Niveles de metilación de LINE-1 después del tratamiento con Decitabina. Se cuantificaron los niveles de 5-metilcitosina de LINE-1 en el ADN genómico y se midió la densidad óptica (DO) a 450 nm. Se observó una disminución significativa en los niveles de DNMT1A y la metilación de LINE-1 (N = 3. ***p < 0,0002). (C) Expresión de la proteína ORF1p (WB) en células FT después del tratamiento con decitabina. Ninguna de las líneas expresó ORF1p antes del tratamiento, pero ORF1p se expresó abundantemente en todas las líneas después de 5 días de tratamiento. La β-actina sirve como control de carga. (D) Comparación de la expresión de LINE-1 ORF1p en células FT después del tratamiento con Decitabine o SGI-110 por WB. Ambos compuestos son igualmente capaces de inducir la expresión de ORF1p a los 3 días. (E) Las células FT tratadas con Decitabine o SGI-110 se examinaron mediante inmunofluorescencia para detectar la presencia de ORF1p (objetivo 10X). (F) Expresión de la proteína ORF1p (WB) en medios acondicionados de células FT después del tratamiento con agentes desmetilantes. COV318 se utilizó como control positivo para la liberación de ORF1p.

Por último, preguntamos si el tratamiento de células FT con decitabina o SGI-110 promueve la liberación de ORF1p. Para ello, tratamos las células FT con DMSO, Decitabine o SGI-110 durante 5 días y analizamos sus medios acondicionados. De acuerdo con nuestros datos de líneas celulares, el tratamiento de células FT con DNMTis condujo a la secreción de ORF1p (Fig. 5F). Juntos, estos datos indican que la metilación del ADN es un mecanismo necesario para restringir la expresión de LINE-1 y la liberación de ORF1p en las células FT.

El genoma humano está repleto de elementos repetitivos intercalados que reflejan la actividad de los elementos transponibles. LINE-1 es una secuencia de este tipo; un elemento genético móvil activo en humanos que se propaga a sí mismo y codifica proteínas19,51,55. Las secuencias LINE-1 no solo son una fuente importante de variación estructural hereditaria, sino que también pueden conducir a inserciones adquiridas en genomas de cáncer19. Aquí informamos sobre la expresión de ORF1p, uno de los productos codificadores de proteínas de LINE-1, en el cáncer de ovario seroso de alto grado. Usamos diferentes enfoques para hacer tres observaciones principales. Primero, mostramos que ORF1p es expresado y liberado por células tumorales y líneas celulares HGSOC primarias derivadas de ascitis y que puede detectarse con confianza en fluidos biológicos que incluyen ascitis y plasma de pacientes con cáncer de ovario utilizando iMRM-MS. En segundo lugar, mostramos que la expresión de ORF1p es un evento temprano en el desarrollo de HGSOC, ya que se expresa en el precursor de FT y, en particular, en lesiones STIC incidentales. Por último, mostramos que la desmetilación del ADN puede activar la expresión de ORF1p en células epiteliales FT inmortalizadas, de acuerdo con la metilación del ADN que actúa como un mecanismo necesario para suprimir la expresión de LINE-1 en estas células benignas.

Se ha informado que una amplia gama de cánceres expresa LINE-1 ORF1p, incluidos los carcinomas renal, esofágico, pancreático, pulmonar, de próstata, de mama y de ovario26,27,29,56,57. Aquí, informamos que las células de cáncer de ovario no solo expresan sino que también liberan ORF1p, lo que es muy relevante desde la perspectiva del desarrollo de biomarcadores clínicos. En este contexto, desarrollamos ensayos de inmunoMRM-MS para detectar péptidos ORF1p proteotípicos que se encuentran en el líquido intersticial tisular de muestras de tejido HGSOC (Gillette et al., manuscrito en preparación). Usamos ensayos iMRM-MS ya que este enfoque tiene varias características clave: (1) la medición de proteínas utilizando un formato que admite la multiplexación de alto nivel de biomarcadores candidatos con un procesamiento de muestras eficiente; (2) el uso de reactivos de afinidad (anticuerpos antipéptido) aumenta la abundancia relativa de los objetivos peptídicos proteotípicos, mejorando la sensibilidad analítica de su detección en biofluidos complejos comúnmente recolectados y medidos en la clínica (p. ej., plasma); y (3) el uso de espectrometría de masas en lugar de un segundo anticuerpo proporciona especificidad de secuencia, asegurando que la medición se deriva del analito previsto34.

Los ensayos iMRM-MS recapitularon en gran medida los hallazgos de transferencia Western en sobrenadantes de líneas celulares comerciales y primarias. En particular, iMRM-MS demostró un gradiente de señal decreciente a medida que aumentaba la distancia desde la fuente de señal desde las muestras peritumorales hasta la ascitis y el plasma, tal como se ha descrito para los niveles de CA-125 que pasan del líquido del quiste ovárico a la ascitis y el plasma en mujeres con HGSOC58 . La correspondencia general entre los niveles relativos de ORF1p en los sobrenadantes de la línea celular primaria y sus muestras de ascitis emparejadas sugiere que los niveles diferenciales podrían servir como un biomarcador de diagnóstico en los fluidos corporales accesibles, pero solo las pruebas sistemáticas en un gran número de muestras de plasma de pacientes HGSOC y controles adecuados pueden evaluar adecuadamente esta hipótesis.

Si bien los resultados de iMRM-MS para ambos ensayos de péptidos configurados estuvieron altamente correlacionados y ambos funcionaron bien en sobrenadantes, solo el ensayo LSFISEGEIK detectó ORF1p endógeno en muestras de plasma de pacientes. Cuando se analizaron muestras adicionales mediante iMRM-MS a partir de plasma sin inmunoafinidad de las proteínas plasmáticas de mayor abundancia (datos no mostrados), el número relativo de muestras en las que se detectó ORF1p se triplicó, hasta ~ 30 %. A pesar de estos avances, y aunque la detección en plasma puede afirmarse con confianza, la baja intensidad absoluta de la señal ORF1p y las correspondientes proporciones bajas de área de pico de luz:pesada impiden una cuantificación precisa en estas muestras. Además, dado que las señales ORF1p están solo marginalmente por encima del ruido en las muestras en las que se detectan, no se pueden hacer afirmaciones sólidas sobre las muestras en las que no se detectó ORF1p. A pesar de estas limitaciones, nuestros resultados ciertamente contribuyen a madurar la implementación potencial de ORF1p como biomarcador de cáncer de ovario y resaltan la necesidad de ensayos aún más sensibles para el estudio de biomarcadores plasmáticos.

La cuantificación de LINE-1 en fluidos biológicos ha sido objeto de estudio en varias publicaciones anteriores, lo que destaca su potencial como biomarcador del cáncer. Con respecto al ADN de LINE-1, la evaluación de LINE-1 por qPCR en el ADN circulante en el suero de pacientes con cáncer de mama ha demostrado ser valiosa para detectar el cáncer de mama en etapa temprana59. En cuanto a la metilación del ADN de LINE-1, los estudios demostraron que, utilizando ADN libre de células (cfDNA), las muestras de suero de melanoma tenían niveles significativamente más altos de LINE-1 no metilado que el suero de donantes sanos60. De manera similar, la hipometilación de LINE-1 de cfDNA en plasma se propuso como un biomarcador de progresión de la enfermedad para el cáncer colorrectal61. Recientemente, un estudio utilizó ELISA digital y microfluidos de gotas (ddELISA) para detectar ORF1p en muestras de suero de pacientes con cáncer de mama. Este enfoque fue más sensible que el estándar de oro actual para la detección de proteínas ultrasensibles62. Juntos, nuestros hallazgos y los anteriores alientan el estudio y el desarrollo de LINE-1 y ORF1p como marcador en el cáncer de ovario.

La etapa de transformación neoplásica en la que se activan los elementos LINE-1 no se entiende claramente. Informes recientes30,31 sugieren que las restricciones normales sobre la expresión de LINE-1 se pierden en las primeras etapas del desarrollo del tumor. Nuestros resultados son consistentes con esos hallazgos, ya que observamos que, si bien ORF1p es negativo en el epitelio FT benigno, está presente en las lesiones precursoras de HGSOC humanas tempranas no invasivas (STIC) y se mantiene a lo largo de la progresión de HGSOC. Es importante destacar que la evaluación de la expresión de ORF1p en lesiones STIC incidentales demuestra de manera única que su expresión es una manifestación de enfermedad temprana en lugar de metastásica.

La metilación del ADN de los elementos LINE-1 se ha postulado como un mecanismo principal de supresión en tejidos adultos normales. En este sentido, probamos si los agentes desmetilantes de ADN podrían inducir la expresión y liberación de ORF1p en líneas celulares FT. Durante la replicación, la decitabina se incorpora al ADN donde puede atrapar covalentemente las enzimas DNMT, creando aductos de proteína de ADN63 y, posteriormente, la degradación de las DNMT64. Nuestros datos mostraron que el tratamiento de las células FT con inhibidores de DNMT, Decitabine y SGI-110, fue suficiente para desencadenar la expresión de ORF1p y su liberación en medios condicionados.

Aunque p53 se ha postulado como un supresor crítico de la expresión y actividad de LINE-1 en células humanas somáticas57,65, nuestros datos sugieren que la deficiencia de p53 por sí sola no conduce a la desrepresión de LINE-1 ni a la expresión de ORF1p. Las líneas de células FT utilizadas en este estudio se inmortalizaron interrumpiendo la vía p5341,42, FT189 y FT194 se inmortalizaron utilizando telomerasa humana transcriptasa inversa (hTERT) y antígeno T SV40, mientras que FT237 y FT240 se inmortalizaron sin oncoproteínas virales, y ninguna de estas líneas expresan ORF1p. Además, ni nosotros ni otros hemos detectado la expresión de ORF1p en las primeras lesiones de las trompas de Falopio que albergan mutaciones de TP53, conocidas como p53 signature30,31, lo que sugiere la participación de mecanismos reguladores adicionales.

En resumen, ORF1p parece expresarse de manera única en las células de cáncer de ovario en comparación con las células de las trompas de Falopio. La presencia de ORF1p en lesiones STIC incidentales indica que su expresión es un evento temprano en la tumorigénesis. La expresión binaria aparente de ORF1p está regulada por la metilación del ADN que se pierde durante la transformación neoplásica y contribuye a la liberación de ORF1p en los fluidos biológicos. Aunque se necesitan ensayos más sensibles, la detección segura de ORF1p en fluidos biológicos del plasma de pacientes respalda su desarrollo como biomarcador candidato para el cáncer de ovario.

Para obtener más información y solicitudes de recursos y reactivos, diríjase al contacto principal, el Dr. Ronny Drapkin, a [email protected]. Este estudio generó nuevos anticuerpos peptídicos LINE-1 ORF1p.

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Nos gustaría agradecer a los miembros de los laboratorios Drapkin, Burns y Carr por sus fructíferos debates, Alexandra Cocco por su ayuda con la evaluación de anticuerpos y reactivos peptídicos estándar utilizados en los ensayos iMRM, Sebastian Vaca con el análisis MSstats de los datos iMRM, Mei Zheng por la inmunohistoquímica, el Dr. Adam Karpf (Universidad de Nebraska) por la útil discusión y el Dr. Andrew Godwin por su generosa provisión de células epiteliales de la superficie ovárica.

Este trabajo fue apoyado por un programa de becas para investigadores mentores de Ovarian Cancer Research Alliance (891470 a PRdS), el China Scholarship Council (YF), el Skacel Family Scientific Scholar Award del Rivkin Center (SMG), el Instituto Nacional del Cáncer EDRN 5U01CA152990 (subadjudicación 217321 para los años 1 a 5 y 227914 para los años 6 a 8) (RD, MB, SC, SS, MG), NCI SPORE en cáncer de ovario P50 CA228991 (RD), la Honorable Tina Brozman Foundation for Ovarian Cancer Research ( RD), la Fundación de Investigación Médica Dr. Miriam y Sheldon G. Adelson (RD), la Fundación Claneil (RD), la Carrera y Caminata para Familiares y Amigos con Cáncer (RD), Shooting for a Cure (RD), Maggie's Memorial (RD), el Fondo Helene Ross Bogutz para la Detección Temprana del Cáncer de Ovario (RD), el Fondo Dotado (RD) del Centro de Investigación del Cáncer de Ovario Marjorie S. Stanek y Lowell H. Dubrow, el Centro Basser para BRCA (RD) y el Fundación Mike y Patti Hennessy (RD).

Estos autores contribuyeron por igual: Sho Sato y Michael Gillette.

Penn Ovarian Cancer Research Center, Universidad de Pensilvania, Facultad de Medicina Perelman, Filadelfia, PA, 19104, EE. UU.

Sho Sato, Pamela R. de Santiago, Yi Feng, Sara Hobday, Marilyn A. Mitchell, Kai Doberstein, Stefan M. Gysler y Ronny Drapkin

Instituto Broad del MIT y Harvard, Cambridge, MA, 02142, EE. UU.

Michael Gillette, Eric Kuhn, Michael Burgess, Kristen Doucette, Paul J. Ippoliti y Steven A. Carr

División de Medicina Pulmonar y de Cuidados Críticos, Hospital General de Massachusetts, Boston, MA, 02114, EE. UU.

miguel gillette

Departamento de Patología, Brigham and Women's Hospital, Boston, MA, 02115, EE. UU.

Michelle S Hirsch

Departamento de Patología y Medicina de Laboratorio, Hospital de la Universidad de Pensilvania, Filadelfia, PA, 19104, EE. UU.

lauren schwartz

Facultad de Medicina de Harvard, Boston, MA, 02115, EE. UU.

Michael Gillette, Michelle S. Hirsch, Steven J. Skates, Kathleen H. Burns y Steven A. Carr

Departamento de Medicina, Universidad de Alabama en Birmingham, Birmingham, AL, 35233, EE. UU.

Michael J Birrer

Bioestadística y Biología Computacional, Hospital General de Massachusetts, Boston, MA, EE. UU.

Steven J. Patines

Departamento de Patología Oncológica, Instituto del Cáncer Dana-Farber, Boston, MA, EE. UU.

Carlos Mendez-Dorantes & Kathleen H. Burns

Basser Center for BRCA, Abramson Cancer Center, University of Pennsylvania, Perelman School of Medicine, Filadelfia, PA, 19104, EE. UU.

Ronny Drapkin

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

SS, MG y RD concibieron el proyecto y el plan experimental. SS, EK, YF, PJI, MAM, MG, PRdS., SH, SMG, CMD, KHB y RD realizaron experimentos y analizaron los resultados. EK, MB, KD, PJI, MG y SAC desarrollaron, realizaron y analizaron los experimentos proteómicos. MSH, LS y RD proporcionaron experiencia en tejidos y patología. SS proporcionó muestras de plasma y apoyo estadístico. Todos los autores ayudaron a redactar y revisar el manuscrito. RD se desempeñó como supervisor general del estudio.

Correspondencia a Ronny Drapkin.

R. Drapkin es miembro del consejo asesor científico de Repare Therapeutics y VOC Health. Ninguno de los otros autores declara intereses en competencia.

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Reimpresiones y permisos

Sato, S., Gillette, M., de Santiago, PR et al. LINE-1 ORF1p como biomarcador candidato en carcinoma seroso de ovario de alto grado. Informe científico 13, 1537 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-28840-5

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Recibido: 16 Agosto 2022

Aceptado: 25 de enero de 2023

Publicado: 27 enero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-28840-5

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